Цель исследования – диагностика потенциально чрезвычайно опасных, угрожающих жизни опухолей уринарного тракта высокой степени злокачественности (HGUC). Цитологическое исследование введено в мировую медицинскую практику в 1945 году Дж. Папаниколау.
Уринарный тракт – это анатомические структуры, выполняющие функцию мочевыделения. Он состоит из почечных лоханок, мочеточников, мочевого пузыря и уретры. Переходный эпителий или уротелий, покрывающий уринарный тракт при определённых обстоятельствах становится источником новообразований, которые весьма разнообразны, как по морфологическому строению, так и по степени злокачественности. Первичные злокачественные опухоли почечной лоханки и мочеточника составляют всего 5-6% от всех опухолей уротелия, так что, основная доля угрожающей жизни патологии приходится на опухоли мочевого пузыря (МЗ РБ ГУ РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова. «Алгоритмы диагностики и лечения злокачественных новообразований», 2012).
Ежегодно в РБ выявляют 1000-1200 новых случаев рака мочевого пузыря на различных стадиях развития. Страдает преимущественно мужское население. В Европейских странах, в структуре общей онкологической заболеваемости, рак мочевого пузыря занимает 4-е место у мужчин и 14-е – у женщин. В подавляющем числе случаев – это уротелиальная карцинома высокой степени злокачественности (HGUC), которая проявляет себя клинически гематурией, т.е. появлением крови в моче. За последние 20 лет в нашей стране заболеваемость выросла почти в 2 раза. Относительно высокий показатель отношения смертности к заболеваемости, который составляет 0.33, означает, что каждый третий пациент погибает, а это, без сомнений, свидетельствует об отсутствии эффективных неинвазивных методов ранней диагностики.
В последние годы учёные рассматривают возможность вирусной природы
рака мочевого пузыря. Полиомавирус человека 1
, более известный, как полиома-
BK-вирус
, уже многие годы притягивает к себе внимание исследователей в данной области, как потенциально опасный фактор развития неопластических процессов мочевыводящей системы. Этот вирус широко распространён среди всей популяции человека. Можно сказать, что им инфицировано до 90% взрослого населения нашей планеты. Впервые, штамм человеческого полиомавируса был выделен из мочи ещё в 1971 году. В названии этого штамма заглавные латинские буквы BK соответствуют инициалам того пациента, у которого его обнаружили. И за последние два десятилетия, наши представления о роли этого вируса серьёзно эволюционировали. Неоспоримым является тот факт, что при снижении иммунологической защиты, а именно при проведении цитостатической терапии у пациентов с аллографт трансплантацией почек, полиома-BK-вирус является основной причиной BKV аллографт нефропатии, уретрального стеноза и геморрагического цистита (Drachenberg CB, Hirsch HH, Ramos E, Papadimitriou JC (2005). Hum. Pathol. 36: 1245-1255).
Вирус проникает в организм человека через верхние дыхательные пути и долгое время бессимптомно персистирует преимущественно в уротелии, а также в костном мозге, вызывая латентное инфицирование. Здоровая иммунная система контролирует бессимптомное пребывание вируса в организме человека. Однако, при нарушеннии иммунного надзора, возникающего по тем или иным причинам, вследствие угнетения функции иммунитета, происходит активация BKV-вируса. А морфологическим отражением перехода из латентного состояния в активное, является появление специфических клеток. В уротелиальном эпителии вирусные частицы образуют внутриядерные включения, в результате чего, клетка приобретает очень характерные морфологические черты. Первое описание таких клеток с включениями вирусных частиц дал доктор Koss LG 40 лет назад, обнаружив их в моче пациента после проведенной трансплантации почки. Он назвал их Decoy-клетки. Они могут быть 4-х типов и до последнего времени, среди цитопатологов доминируют представления, что эти инфицированные клетки нельзя относить к злокачественным. Но их появление в моче пациента с аллографт трансплантацией, является самым ранним признаком угрозы BKV аллографт нефропатии. На данных рисунках представлены 4 морфологических типа Decoy-клеток.
Иными словами, Decoy- клетки – самые ранние предвестники отторжения трансплантата. Но только с внедрением в практику жидкостных технологий приготовления препарата из свежевыпущенной мочи или из смыва мочевого пузыря, с окраской по Папаниколау, стало возможным обнаруживать эти клетки, и с высокой чувствительностью и специфичностью отличать их от злокачественных. В настоящее время обнаружение
Decoy-клеток в моче является скрининговым тестом BKV нефропатии.
Кроме того, у пациентов, перенесших трансплантацию почки, наряду с Decoy-клетками, часто обнаруживают клетки уротелия, с признаками выраженной клеточной атипии, соответствующими цитоморфологическим характеристикам уротелиальной карциномы высокой степени злокачественности, а также клетки, которые несут в себе одновременно черты, присущие и Decoy-клеткам, и клеткам HGUC. Эти клетки не только имеют смешанные черты Decoy-клеток и злокачественных, но и несут в себе протеины (SV-40 T) полиома-BK-вируса (Galed-Placed I, Valbuena-Ruvira L. Diagn Cytopathol.2011 Dec;39(12):933-7). Многие из клинических случаев, описанных в литературе, свидетельствуют о возможной онкогенной роли полиома-BK-вируса в возникновении уротелиальной карциномы (Hassan S, Alirhayim Z, Ahmed S, Amer S. Case Rep Nephrol.2013; 2013:858139). Протеины BKV оказывают повреждающее действие на синтез белков-супрессоров опухолевого роста (р53), что приводит к нарушению процесcов восстановления ДНК. Этот патогенетический механизм лежит в основе возникновения генетически нестабильных изменений, приводящих к трансформации нормального уротелия сначала в диспластичный, а затем в уротелиальную карциному высокой степени злокачественности (HGUC). HGUC характеризуется высокой частотой рецидивов и прогрессии до мышечно-инвазивных стадий Т2,Т3,Т4 с метастазами в лимфатические узлы. в 95% случаев всех смертельных исходов от рака мочевого пузыря устанавливают диагноз HGUC.
Итак, достоинства цитологического исследования уротелиального тракта:
- Неинвазивность процедуры (анализ из «баночки»);
- Высокая специфичность диагностики HGUC, приближающаяся к 100%;
- Высокая чувствительность диагностики HGUC ~ 80%;
- ~30-70% пациентов с HGUC выживают;
- ~5-15% случаев HGUС прогрессируют; статистика США.
- 535 000 пациентов с раком мочевого пузыря выжили.
Предпочтительной технологией приготовления цитологического препарата мочи является жидкостная осаждением (BD SurePath), которую мы используем в нашей лаборатории. Тонкослойные мазки позволяют проводить дальнейшую диагностику с использованием всего арсенала молекулярно-генетических методов (иммуноцитохимия, FISH, и т.д.).
Цитологический диагноз HGUC объединяет в себе все генетически нестабильные злокачественные опухоли уротелия, гистологически весьма разнообразные. С целью оптимизации подходов к интерпретации уринарной цитопатологии и стандартизации критериев диагностики, на международном конгрессе в Париже, в 2013 году была принята новая цитологическая система классификации. Она во многом напоминает систему Bethesda для цитологического анализа патологии щитовидной железы и цервикального канала.
| Категории | Парижская система оценки цитологии уринарного тракта | Вероятность злокачественной опухоли |
|---|---|---|
| I | Неудовлетворительный/недиагностический материал | 0-10% |
| II | Негативная по уротелиальной карциноме высокой степени злокачественности (NHGUC) | 0-10% |
| III | Атипическая уротелиальная клетка (AUC) | 8-35% |
| IV | Подозрение на уротелиальный рак высокой степени злокачественности (SHGUC) | 50-90% |
| V | Уротелиальная карцинома низкой степени злокачественности (LGUC) | ~10% |
| VI | Уротелиальная карцинома высокой степени злокачественности (HGUC) | >90% |
| VII | Другие опухоли, первичные и вторичные | >90% |
Итак, цитологическое исследование мочи с применением жидкостных технологий приготовления мазка и использованием диагностических критериев Парижской классификации 2014 года, является основным неинвазивным методом диагностики и мониторирования уротелиальной карциномы высокой степени злокачественности.
1423 0
Говоря о методах лабораторной диагностики ранней онкологической патологии в мочевом пузыре, их сразу следует разделить на рутинные методы, каковыми являются микроскопическое и цитологическое исследование осадка мочи, и довольно сложные биохимические, позволяющие выявить определенные состояния гомеостаза, не только характерные для конкретной формы злокачественной опухоли, но и предшествующие ее возникновению.
Мы имеем в виду биохимическое исследование мочи, которое выявляет нарушенный обмен триптофана, проявляющийся появлением в моче его канцерогенных метаболитов.
Это может быть и у больных раком мочевого пузыря, и у практически здоровых людей, что свидетельствует об определенной предрасположенности к возникновению заболевания и считается одним из эндогенных факторов риска.
То же самое можно сказать и о значении повышенной активности в-гиалуронидазы - фермента мочи, под воздействием которого в мочевом пузыpe происходит распад неканцерогенных комплексов с высвобождением активного начала. Так, комплекс, состоящий из 2-амино-1-нафтола, соединенного с глюкуроновой или серной кислотой в печени и поэтому потерявшего свои канцерогенные свойства, под действием в-гиалуронидазы или сульфатазы мочи распадается в мочевом пузыре с образованием активного 2-амино-1-нафтола, оказывающего канцерогенное воздействие на уроэпителий.
Своевременное выявление ранней онкологической патологии
Говоря о своевременном выявлении ранней онкологической патологии (РОП) в мочевом пузыре, следует согласиться с мнением М. Mebel et al. о том, что, несмотря на значительный прогресс в области диагностики, рутинные методы - исследование эритроцитурии, осмотр доступных отделов мочевого тракта, ректальная пальпация - остаются основой для раннего диагноза, но явно недостаточно используются. Достаточно указать на то, что у многих больных, обратившихся в поликлинику с неурологическими жалобами, наличие в общем анализе мочи эритроцитов не служило поводом для направления к урологу ни для врачей широкого профиля, ни для узких специалистов.А между тем, проводя проспективное эпидемиологическое исследование контингента из 3400 практически здоровых людей с целью выявления у них РОП мочевого пузыря, мы выполнили 2143 лицам (63,0%) микроскопическое исследование осадка мочи, а 696 (20,5%) - цитологическое и выявили значительный процент патологии у лиц, не собиравшихся обращаться за медицинской помощью, чувствующих себя практически здоровыми.
Гематурия выявлена у 18,1% мужчин в группе риска и 7,9 - контроля, у женщин соответственно, - 23,1 и 10,7%. Естественно, что все эти люди нуждаются в дальнейшем урологическом обследовании, которое позволит установить причину урологической патологии, в том числе и онкологической. Здесь следует подчеркнуть, что лабораторная диагностика ранней онкологической патологии в мочевом пузыре не может быть самостоятельным методом, она, как правило, должна быть дополнена цистоскопическим исследованием с биопсией .
Показаниями для проведения цитологического исследования осадка мочи служат все формы макро- и микрогематурии, неясные дизурии, цисталгии, злоупотребления аналгетиками, профессиональные контакты с ароматическими аминами. Цитологическое исследование незаменимо при опухолях мочевого пузыря интраэпителиального типа - cancer in situ, которые не могут быть выявлены эндоскопически, а также при раке дивертикула мочевого пузыря, стриктурах уретры, малой емкости органа.
Следует еще раз подчеркнуть, что этот теоретически идеальный метод не может быть самостоятельным ни в диагностике рецидивов рака в мочевом пузыре, ни, тем более, при выявлении РОП. По данным многих авторов, это подтверждает довольно высокий процент несовпадений цистоскопической картины с результатами цитологии мочи, только у 70,0% больных уроэпителиальным раком цитологическое исследование выявляет раковые клетки.
J. Tostain et al., анализируя 500 цитологических исследований у 342 больных уроэпителиальными опухолями, показали, что при типичных папилломах мочевого пузыря цитологическое исследование неэффективно, при инфильтративных раках низкой степени злокачественности цитология мочи позволяет поставить диагноз в 66,0% случаев, при высокой - в 80,0%.
Рядом авторов (Mansat A. et al., Droese et al.) установлена четкая корреляция между степенью анаплазии клеток и цитологическим выявлением опухоли. В частности, показано, что при использовании классификации Bergevist I, II, III степени в зависимости от анаплазии клеток, при первой степени опухоль выявлена лишь в 19,0%, второй - 30,0, третьей - 70,0.
До сих пор нет общепринятых цитологических методов исследования опухолей мочевого пузыря. Одни исследователи считают ценным метод эксфолиативной цитологии при исследовании мочевого осадка свежевыпущенной мочи (Енохович В.А., 1966; О.П. Ионова с соавт., 1972), другие предпочитают аспирационную биопсию (Volter D. et al, 1981), третьи указывают, что наилучшие результаты дает метод смыва слизистой оболочки мочевого пузыря (Ломоносов Л.Я., 1978).
Ошибки в цитологической диагностике
Ошибки в цитологической диагностике определяют несколько факторов: плохой материал, который получен при воспалительном процессе или некрозе опухоли, незначительное его количество или слабо выраженная атипия клеток. Поэтому, естественно, ведется поиск наиболее рационального взятия материала для работы. Так N. Holmguist указывает на высокую степень выявляемости рака мочевого пузыря (1,2 на 1000) при цитологическом исследовании влажных препаратов осадка мочи и предлагает использовать эту методику для скрининга.Л.Я. Ломоносов рекомендует для массовых профилактических осмотров групп повышенного риска способ активного смыва мочевого пузыря в собственной модификации, когда перед проведением смыва тщательно промывается мочевой пузырь фурациллином, после этого вводится 50-100 мл спиртового раствора новокаина из расчета 15 мл 96° спирта на 100 мл 1% раствора новокаина .
Через 5-10 минут раствор собирается в чистую посуду. После макроописания смыва материал центрифугируется при 3000 оборотов в 1 минуту в течение 15 минут, Надосадочная жидкость смывается, а из центрифугата приготовляются мазки.
При этом ряд авторов работали над рациональной техникой приготовления мазков, поскольку задержка внедрения цитологического исследования во многом обусловлена трудностями окраски клеток в моче. Поэтому С. Fiedler et аI. проводят несколько окрасок - метиленовым зеленым, пиронином и хромалауном по модифицированному ими способу.
Ложноположительные результаты чаще всего связаны с неправильной оценкой уротелиальных клеток с диспластическими изменениями при мочекаменной болезни, хроническом воспалительном процессе. Так, из 135 больных с конкрементами верхних мочевых путей у 7,2% установлена цитологическая картина аналогичная высокодифференцированному раку. В моче лиц, длительно страдавших мочекаменной болезнью, С. Dimopoulos et al. наблюдали наличие клеток 3 и 4 степени злокачественности по Паппаниколау и исчезновение их после оперативного удаления камней.
О.П. Ионова с соавт. при воспалительных процессах находили в цитограммах атипичные клетки, мало отличающиеся от опухолевых. Интерпретация цитограмм представляется довольно сложным делом, может быть, поэтому до сих пор нет общепринятых критериев озлокачествления эпителиальных опухолей мочевого пузыря.
Имеющиеся многочисленные данные по этому вопросу касаются, в основном, диагностики рецидивов рака и достаточно редких случаев распознавания "рака в клетке" - cancer In situ. Лишь у отдельных авторов описаны цитограммы при простой и пролиферирующей папилломах мочевого пузыря - Г.А. Арзуманян, В.А. Енохович, О.П. Ионова с соавт., Л.Я. Ломоносов.
Ряд других - М. Beyer-Boon et al. указывают на то, что папилломы вообще не могут быть диагностированы на основании цитограмм, последние при типичных папилломах не отличаются от нормограмм и только обнаружение папиллярных фрагментов опухоли позволяет поставить диагноз.
Дело в том, что цитограммы смывов мочевого пузыря в норме бедны клеточными элементами. Большинство встречающихся клеток - это клетки покровной зоны переходного эпителия. Они крупных размеров, полигональной или вытянутой формы. Ядра мелкие, округлые или овальные, расположены центрально или слегка эксцентрично.
Клетки промежуточной зоны цилиндрической формы, располагаются или в виде папиллярных папоротникообразных структур, или в виде розеток, или в виде виноградоподобных гроздьев. Ядра овальные, хроматин мелкоглыбчатый, равномерно распределяющийся по площади ядра. В отдельных работах обращается внимание на специфические для смывов гигантские многоядерные клетки с частыми фигурами митоза.
Из неэпителиальных элементов обнаруживаются эритроциты, лейкоциты, кристаллы солей. В работе А.В. Журавлева указывается на тс что в смывах в норме не должно быть форменных элементов. При воспалении отмечается увеличение количества клеточных элементов за счет клеток промежуточной и базальной зон, переходного эпителия и клеток воспалительной природы.
В мазках при типичной папилломе обнаруживаются одинаковые по величине клетки цилиндрической, овальной, округлой и веретенообразной формы. Могут встретиться "хвостатые" клетки. Ядра их мономорфные с компактной структурой хроматина, содержат 1-2 ядрышка. Ядерно-цитоплазменное соотношение не нарушено.
По мнению Г.А. Арзуманяна, характерным является отсутствие многоядерных клеток, свойственных верхнему, дифференцированному слою переходного эпителия. М.П. Птохов считает наиболее характерным моментом - наличие вытянутых хвостатых клеток.
Цитологические критерии малигнизации папиллом
Цитограммы пролиферирующих папиллом отличаются более выраженным полиморфизмом и полихромазией клеток. Ядра увеличены в размерах, в них увеличивается количество ядрышек. В.А. Енохович находит характерным для данной группы папиллом наличие овальных и округлых клеток опухоли. Н. Hanschke отмечает большое количество двуядерных клеток.Л.Я. Ломоносов выделяет следующие цитологические критерии малигнизации папиллом:
Повышенную митотическую активность клеток;
полиморфизм ядер с огрублением структуры;
уменьшение содержания гликогена в цитоплазме;
увеличение клеточных слоев более пяти.
Он указывает, что иногда начинающуюся малигнизацию легче обнаружить в цитограммах, нежели гистологических препаратах.
При переходноклеточной карциноме мочевого пузыря все авторы отмечают полиморфизм, полихромазию клеток цитограммы, нарушение ядерноцитоплазменного соотношения в пользу ядра, изменение структуры хроматина. гипертрофию и гиперплазию ядрышек и дистрофические изменения цитоплазмы. Б.Л. Полонский и Г.А. Арзуманян характерным для рака считают многоядерность клеток.
Естественно, что такое исследование должно производиться опытным специалистом и требует относительно много времени. Поэтому в целях превращения в автоматический скрининг-метод начали использовать импульсную цитофотометрию, которая позволяет подсчитать за одну секунду 1000 клеток, окрашенных флуоресцирующей краской.
В ряде работ (Klein F. et al., 1982; Frankfurt O. et al., 1984; Dean P. et al., 1986) указывается на перспективную роль в диагностическом отношении coстояния цитологического исследования мочи и метода проточной цитометрии при котором производится измерение содержания ДНК, РНК и размеров ядер.
С помощью импульсной цитофотометрии изучали количественно ДНК и белки в эпителиальных клетках свободно вытекающей мочи, промывных видах мочевого пузыря и суспензии из ткани опухоли. Таким образом была выявлена связь между наличием анэуплоидных клеток в смывах мочевого пузыря и развитием инвазий у больных.
Установлено, что большинство поверхностных опухолей мочевого пузыря диплоидно, а инвазию сопровождает анэуплоидность. Поэтому проточно-цитометрический анализ содержания ДНК является количественной мерой для предсказания степени злокачественности опухоли, а также для диагностики cancer in situ.
В работе К. Nielsen дана стереологическая оценка объема ядер илиэистой оболочки мочевого пузыря в норме и злокачественном процессе. Автор исследовал 27 биоптатов из мочевого пузыря: 10 - в норме, 5 - при инфекции, 12 - при опухолях. Морфометрическое исследование установило средний объем ядра в норме и при инфекции, равным 133 и 182 мкм3, при cancer in situ - 536 мкм3.
Помочь выявлению клеток с повышенным содержанием ДНК может предлагаемый фирмой "ЦИТОДИАГНОСТИКА" тест, основанный на количественном определении флуоресценции. Применяемую краску связывают клетки с повышенным содержанием ДНК и это обстоятельство позволяет выявить одну раковую клетку среди тысячи нормальных. Фирма предлагает применять этот тест для скрининга контингентов с повышенным риском заболевания раком мочевого пузыря.
Но следует отметить, что использование предлагаемых методик с целью профилактики опухолей мочевого пузыря встречает большие затруднения, которые начинаются сразу же, уже при заборе мочи - в несвежей моче клетки значительно изменяются. Понятно, что для профилактических осмотров наиболее приемлемым цитологическим исследованием может стать исследование осадка свежевыпущенной мочи, ни метод аспирационной биопсии, ни метод смыва со слизистой оболочки мочевого пузыря не могут стать массовыми.
Цитологическое исследование осадка мочи, примененное нами с целью выявления ранней онкологической патологии мочевого пузыря в профилактически обследуемых контингентах не оправдало наших надежд - ни разу при выполнении обследования 696 практически здоровым лицам, из которых 185 (38,6%) относились к группе риска, а 511 (17,4%) - к контрольной, признаков атипии клеток не было установлено, хотя исследование проводилось опытными цитологами в центральной цитологической лаборатории города
Отдельные методы лабораторного исследования
Отдельные методы лабораторного исследования позволяют выявить известную предрасположенность к возникновению этой формы рака. Мы имеем в виду эндогенные факторы риска - нарушенный обмен триптофана с появлением в моче его канцерогенных метаболитов - 3-оксиантраниловой кислоты, 3-оксикинуренина, кинуренина и др а также повышение активности в-гиалуронидазы мочи.Наличие канцерогенных метаболитов триптофана в моче свидетельствует о повышенном риске заболевания, часто определяется у больных раком мочевого пузыря, в том числе и рецидивного, указывает на необходимость проводить коррекцию обмена триптофана, т.е. заниматься биохимической профилактикой опухоли.
При формировании групп риска по эпидемиологическим тестам выявление из них лиц с наличием канцерогенных метаболитов триптофана в моче помогает еще более сузить круг лиц. нуждающихся в пристальном внимании уролога.
Для определения спектра метаболитов триптофана в моче обследуемых можно использовать метод одномерной нисходящей хроматографии на бумаге. Экстракцию метаболитов производят однократно из 100 мл утренней мочи по методу Makino в модификации Wachstein, Lobel.
Для этого мочу насыщают сернистым аммонием для осаждения белков и солей. Затем мочу фильтруют. К полученному фильтрату добавляют 20 мл расплавленного фенола и в течение 20-25 минут встряхивают на универсально-встряхивательном аппарате. Полученную смесь отстаивают в делительной воронке, где быстро разделяются два слоя: верхний - желтый с коричневым оттенком - слой фенола, нижний - бесцветный - слой мочи.
Нижний удаляют, к верхнему добавляют 20 мл серного эфира и энергично встряхивают для улучшения растворения фенола в эфире. Фенол при этом переходит в верхний, более светлый слой, а нерастворимая в эфире водная фракция, содержащая ароматические производные триптофана остается в нижней части делительной воронки в виде темного маслянистого слоя объемом 0,5-0,7 мл.
Этот слой осторожно сливают в выпаривательную чашку и высушивают в вытяжном шкафу. Высушенный экстракт растворяют в 0,2 мл дистиллированной воды и в количестве 0,02 мл наносят на хроматографическую бумагу ("Ленинградская медленная"), предварительно промытую смесью эфира и спирта в соотношении 3:1.
После высушивания бумагу помещают в предварительно насыщенную растворителями камеру. В качестве растворителя используют следующую систему растворителей - Н-бутиловый спирт: ледяная уксусная кислота: вода - 4:1:1. Разгон производят при комнатной температуре в течение 20-24 часов.
После этого хроматограммы высушивают и обрабатывают реактивом Эрлиха 12 г парадиметиламинобензальдегида + 20 мл 6NHCI + 80 мл этилового спирта). Сразу же после этого на хроматограммах появляются пятна желто-оранжевого цвета, которые дают с этим реактивом мочевина и ароматические производные триптофана, и пятна голубовато-сиреневого цвета обусловленные индольными производными последнего.
По характерной окраске с реактивом Эрлиха, величине Rf и сравнению со стандартами описанный метод позволяет идентифицировать следующие метаболиты триптофана - мочевину, триптамин, индикан, триптофан, 3-оксикинуренин, кинуранин, 3-оксиантраниловую кислоту. Последняя является наиболее сильным эндогенным канцерогеном для уроэпителия, дает характерное розовато-оранжевое окрашивание с реактивом Эрлиха и величину Rf, равную 0,75-0,8.
Определение активности |киалуронидазы мочи проводится с той же целью. Но этот метод позволяет дифференцировать папилломы мочевого пузыря от инвазивного рака и большинством авторов расценивается как вспомогательный при диагностике эпителиальных опухолей мочевого пузыря
Активность фермента в моче определяется общепринятым фенолфталеиновым методом. Для этого собирается моча за сутки под тонким слоем толуола, который предохраняет ее от разложения; затем определяется ее общии объем, удельный вес, наличие белка, лейкоцитов, сахара и обязательнo проводится посев на микрофлору.
Последний необходим в связи с тем, что различные микроорганизмы, особенно кишечная палочка, могут быть источником в-гиалуронидазы. В случаях инфицирования мочевого пузыря моча из дальнейшего исследования исключается.
Затем из каждого образца отбирается по 4-5 мл мочи, которую центрифугируют на центрифуге ЦНЛ-2 при 8-9 тысячах оборотов в течение 8-10 минут. В дальнейшем по количеству исследуемых проб в градуированные стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл наливают 0,5 мл 0,1 М ацитатного буфера, сюда же добавляют 0,5 мл 0,05% раствора субстрата фемолфталеинглюкуронида (фирма Sigma) и лишь в самом конце исследуемой и предварительно отцентрифугированной мочи.
Добавление щелочи делало PH смеси равным 10, 2-10, 4, т е. тот оптимум, при котором происходит и наиболее интенсивное малиново-красное окрашивание отделившегося под влиянием мочевой в-гиалуронидазы фенолфталеина. Дальнейшее определение производится на спектрофотометре СФ-4 при длине волны, равной 540 мм
Окрашенные образцы сравнивают с так называемыми "пустыми" баннами, которые содержали те же самые растворы и в тех же самых концентрациях и количествах, но не подвергались инкубации и готовились непосредственно перед определением фенолфталеина в каждом опытном образце.
Количество выделившегося фенолфталеина определяют по предварительно составленной калибровочной шкале с последующим перерасчетом на 1 мл за 1 час инкубации.
Уровень активности энзима при анализе мочи здоровых лиц колебался от 0,4 до 1,1 и составлял в среднем 1,0 ЕД. Фишмана в 1 мл/час. При папилломах мочевого пузыря отмечается повышение активности фермента в 1,2-1,4 раза. Причем, это повышение является постоянным и не зависит от проводимых лечебных мероприятий. При раке мочевого пузыря активность в-гиалуронидазы в моче повышена не менее, чем в 2-3, а иногда и более раз достигая 5 ЕД Фишмана.
При определении активности этого фермента следует учитывать, во-первых, сопутствующие заболевания у пациентов. Это касается, прежде всего, гепатитов и панкреатитов, которые сами по себе дают резкое увеличение его активности в моче. Во-вторых, следует подчеркнуть, что даже про ведение одной лишь цистоскопии, не говоря о более сложных хирургических вмешательствах, сразу же приводит к повышению уровня активности фермента в моче по сравнению с исходными данными, и только через 8-10 дней активность в-люкуронидазы возвращается к исходным цифрам.
По данным М.Н. Власова с соавт., которые мы здесь приводим не отмечается различий в повышении или уменьшении активности фермента в зависимости от возраста и пола больных, а также химиотерапевтического или лучевого методов лечения.
Этот метод авторы используют как вспомогательный для диагностики опухолей эпителиального типа в мочевом пузыре. Он же может быть рекомендован при проведении мероприятий по биохимической профилактике рака мочевого пузыря, направленной на снижение активности в-люкуронидазы в моче для контроля за этой активностью.
Естественно, что из-за трудоемкости и сложности, метод не может применяться в качестве скринингового, но в группах риска применение его вполне оправдано с целью определения лиц, имеющих важный эндогенный фактор риска и в этой связи нуждающихся в соответствующих профилактических мероприятиях.
Пряничникова М.Б.
Цитологическое исследование мочи, или анализ урины на атипичные клетки, представляет собой изучение структуры элементов этой биологической жидкости под микроскопом. Оценка материала проводится для установления наличия или отсутствия в клетках признаков злокачественного перерождения и других патологических процессов. Метод позволяет вовремя обнаружить или контролировать заболевания органов мочевыделительной системы.
Назначение исследования
Моча на цитологию сдается при таких состояниях:
- подозрение на новообразование в мочевом пузыре, а также почках, мочеточниках, уретре, предстательной железе (простате). Показанием является гематурия – наличие в урине клеток крови – эритроцитов. В некоторых случаях анализ назначают при нарушении мочеиспускания;
- контроль возможного рецидива рака мочевыводящих путей;
- невозможность использовать кольпоскопию и другие методы для изучения состояния половой системы у женщин (у девственниц, во время менструации, при обширных воспалениях). В этом случае исследуются клетки мочи.
Цитология осадка урины не может диагностировать такие доброкачественные опухоли мочевого пузыря, как липому, фиброму, лейомиому, нейрофиброматоз, а также патологическое разрастание тканей – эндометриоз. Однако метод позволяет вовремя выявить папилломы, предупредив их перерождение, а также обнаружить раковые клетки.
Как подготовиться к цитологическому анализу мочи
Исследование не требует специальной подготовки. Перед процедурой желательно провести гигиену половых органов, а затем собрать урину в стерильный контейнер, герметично закрывающийся крышкой.
Доставить образец в лабораторию желательно в течение двух часов.
Время забора жидкости зависит от направления исследования:
- Для анализа гормональных сдвигов на протяжении менструального цикла женщины требуется первая порция утренней мочи, содержащая больше всего клеточных элементов, хотя иногда используется материал, взятый в другое время суток.
- Для обнаружения атипичных клеток, наоборот, не рекомендуется изучать утреннюю урину, лучше подождать 3 часа после первого мочеиспускания и помочиться в емкость, собрав всю выделяемую жидкость.
- Самые точные результаты при опухолях мочевого пузыря получаются при цитологии мочи, выделенной путем аспирации через катетер – когда жидкость отсасывают шприцем из полости органа.
Этот метод проводит оценку микрофлоры человека О чем расскажет цитологический тест
На атипичные клетки
Диагностика новообразований мочевыводящих путей основана на слущивании клеток этих опухолей и попадании их в урину:
- При доброкачественном процессе в материале выявляют отдельные клетки или целые пласты переходного эпителия (слоя, выстилающего внутреннюю поверхность мочевого пузыря), строение которого напоминает нормальный эпителий органа. Форма этих элементов часто веретенообразная, вместе с ними в моче фиксируют наличие эритроцитов.
- При раке мочевого пузыря клетки переходного эпителия имеют выраженные признаки атипии – их строение отличается даже друг от друга. Одновременно в образце присутствуют эритроциты в большом количестве и некротические массы.
В лаборатории из осадка материала готовят нативные (неизмененные) и окрашенные специальными способами мазки. Затем под микроскопом изучают морфологический состав клеток. Кроме наличия доброкачественной или злокачественной опухоли, цитологический анализ помогает обнаружить другие поражения мочевыводящих путей, например, воспалительный процесс.
Кроме этого, цитологию делают тем больным, кто находится на завершающей стадии лечения заболевания Результаты исследования на атипичные клетки могут быть такими:
- Неудовлетворительный образец – собранная моча не подходит для исследования (содержит недостаточное число клеток или примеси, которых не должно быть в материале). Нужно повторить диагностику.
- Анализ отрицательный – раковые клетки в урине отсутствуют.
- Атипичная цитология мочи – в клетках образца найдены некоторые изменения, но без злокачественных признаков.
- Подозрительная цитология – клеточный материал не является нормальным, возможен рак.
- Положительный анализ – в урине присутствуют клетки злокачественной опухоли.
Чувствительность метода составляет около 90%. Однако исследование может иметь погрешности, на это влияют инфекционные поражения мочевыводящих путей, недостаточное количество клеток, камни в мочевом пузыре или почках, внутрипузырные инстилляции (вливание медикаментов). Если анализ окажется положительным, для подтверждения диагноза прибегают к цистоскопии – биопсии (отщипыванию) тканей мочевого пузыря с последующим микроскопическим исследованием.
Преимущество данного анализа в том, что цитологический тест по сравнению с другими исследованиями не требует много времени На колебания гормонального фона
В этом случае также изучают нативные и окрашенные мазки, а затем подсчитывают количество в них клеток разных типов, среди которых:
- базальные;
- промежуточные;
- базофильные (ороговевающие);
- ацидофильные (ороговевшие);
- безъядерные ацидофильные.
Особое внимание уделяют последним – число этих элементов в разные дни цикла составляет 2-20% и указывает на выделение гормонов надпочечников (больше, чем яичников).
Прочие показатели
Микроскопия осадка мочи входит в состав общего анализа урины и может выявить и другие патологии. Например, при уровне лейкоцитов выше нормы говорят о воспалительном процессе, а обнаружение бактерий или грибков свидетельствует об инфекциях мочеполовых путей.
Цитологический анализ осадка мочи - это диагностический метод для определения заболеваний мочеполовой системы , который позволяет выявить наличие воспалительных и онкологических процессов на ранних стадиях.
Назначается данное исследование врачом при подозрении развития у пациента раковой опухоли мочевых путей , а так же используется как способ контроля за лечением раковых заболеваний.
| Сроки выполнения | 3-5дней |
| Синонимы (rus) | Микроскопия мочевого осадка |
| Методы | Фильтрация мочи, центрифугирование |
| Единицы измерения | шт. |
| Подготовка к исследованию | соблюдение гигиены мочеполовой системы |
| Исследование первой порции мочи | |
| Использование стерильной емкости, не обработанной химическими моющими средствами | |
| Тип биоматериала и способы его взятия | Моча |
Впервые подобное диагностирование было проведено для диагностики рака мочепроводящих путей . А затем метод стал использоваться для определения сдвигов гормонального фона в менструальном периоде, в результате чего удалось обнаружить, что содержание клеток в осадке мочи изменяются циклично, как и влагалищный эпителий.
Подобные колебания в количестве и качестве клеточного материала осадка мочи объясняются функциональными особенностями работы женской половой системы. При этом формирование многослойного плоского эпителиальной ткани влагалища, эпителиальной ткани в треугольнике Льето мочевого пузыря и эпителия уретры в период эмбриологического развития происходит из одного урогенитального синуса, чем и объясняется их взаимосвязь.
Методика диагностики предполагает использование первых порций мочевых выделений с утра, которая содержит наибольшее число элементов клеток. Возможен и более поздний сбор материала и даже его хранение, но качество анализа при этом, все-таки, снижается.Моча собирается в чистую, желательно стерильную емкость,которую не очищали средствами бытовой химии. Полученный материал фильтруют, используя ватный фильтр, уложенный в воронку. Осадком на вате делается мазок на предметное стекло поверх небольшого слоя белка куриного яйца, нанесенного заранее. Закрепляют с помощью 95% процентного спирта и эфира в пропорции 1:1 - 2 минуты. Затем окрашивают по Романовскому и подсчитывают число клеток.
Второй метод предполагает отбор 50 мл мочи, который 10 минут центрифугируют, образовавшийся на дне пробирки слой с помощью пипетки капают на предметное стекло и вновь закрепляют смесью эфира и спирта, затем производится окраска, чаще всего, полихромным методом и подсчет 100 или 200 клеточных элементов, затем высчитывается индекс.
В норме в моче должны содержаться пять типов клеток:
- безъядерные в объеме 2-20% для женщин в детородном возрасте. При более высоком содержании необходимо обратить внимание на состояние надпочечников пациента;
- базальные;
- базофильные ороговевающие;
- ацидофильные ороговевшие;
- промежуточные.
Как показывают исследования, у здоровой женщины в 20-30 лет эозинофильный индекс и кариопикнотического индекса мазка из осадка мочи и мазка влагалища изменяются в равных пропорциях. Соответственно, диагностическая эффективность обоих мазков равнозначна. Поэтому цитологический метод нередко назначают при невозможности взять мазок из влагалища. Он позволяет поставить диагноз на ранних стадиях, хотя результат исследования не 100% говорит о наличии раковой опухоли .
При возникновении затруднений в использовании кольпоцитологического метода (в момент кровотечений, при воспалительном процессе во влагалище и , а также у девственниц) функциональное состояние половой системы можно изучать у женщин путем цитологического исследования осадка мочи (уроцитограмма).
Цитологическое исследование осадка мочи впервые было произведено в урологической практике для выявления рака мочевыводящих путей. В дальнейшем этим методом стали пользоваться для установления гормональных сдвигов в менструальном цикле, так как было обнаружено, что клеточные элементы осадка мочи претерпевают аналогично влагалищному эпителию циклические изменения.
Циклические изменения количества и качества клеток осадка мочи связаны с функциональным состоянием женской половой системы. Взаимосвязь между реакцией влагалищного эпителия и клеточным составом мочи и уровнем содержания половых стероидных гормонов в женском организме объясняется их эмбриологической общностью. Многослойный плоский эпителий влагалища, эпителий треугольника Льето мочевого пузыря и эпителий уретры образуются из урогенитального синуса.
Методика . Для цитологического исследования осадка мочи лучше пользоваться первой порцией утренней мочи, в которой содержится наибольшее количество клеточных элементов. Наряду с этим можно использовать и мочу, полученную в другое время суток. Если необходимо сохранить мочу дольше 12 ч, то во избежание дегенеративных изменений в клеточных элементах в нее добавляют 1/3 объема 95% спирта.
Методы приготовления мазка осадка мочи. 1. Мочу фильтруют через кусочек ваты, помещенный в стеклянную воронку. Осевшими на вату элементами делают мазок на предметном стекле после предварительного нанесения на него тонкого слоя яичного белка. Мазок фиксируют медленно в смеси 95% спирта пополам с эфиром в течение 2 мин. Предметное стекло с мазком может оставаться в фиксирующем растворе в течение многих дней.
2,50 мл мочи центрифугируют в течение 10 мин со скоростью 2000 об/мин. Осадок мочи насасывают пипеткой, 1-2 капли осадка помещают на предметное стекло и фиксируют описанным выше способом. Окраску производят одним из способов, применяемых при цитологическом исследовании влагалищного мазка (см. выше); наиболее целесообразно пользоваться полихромным методом окраски.
В осадке нормальной мочи обнаруживается пять типов клеток: базальные, промежуточные, ороговевающие (базофильные), ороговевшие (ацидофильные) и безъядерные ацидофильные элементы.
Количество безъядерных клеток
в осадке мочи здоровых женщин детородного возраста колеблется в пределах 2-20% и в большей степени связано с выделением надпочечниковых стероидов, чем гормонов, вырабатываемых в яичнике. Высказывается предположение, что индекс содержания без ядерных клеток дает возможность судить о функции надпочечников при изменении функции яичников.
После общей оценки мазка
производят подсчет 100 или 200 клеток и высчитывают индекс.
Динамика содержания в клеточном осадке мочи различных клеток многослойного плоского эпителия в соответствии с фазами менструального цикла приведена на рис. 29. Установлено, что соотношение между различными типами клеточных элементов определяется соотношением половых стероидных гормонов в организме.
По наблюдениям А. Т. Бунина, Momoli и соавт. и др., у здоровых женщин с нормальными менструациями в возрасте 20-30 лет изменения эозинофильного индекса и КПИ в мазках осадка мочи и влагалищных мазках происходят параллельно. В мазках осадка мочи имеются лишь незначительные отличия в диаметре и степени окраски поверхностных клеточных элементов. Высказывается предположение, что диагностическая ценность обоих типов мазков одинакова.
Уроцитограмма
является ценным вспомогательным методом функциональной диагностики яичников.